Pesquisadores do EMBL Hamburgo, trabalhando com cientistas do Instituto de Pesquisa Leibniz de Farmacologia Molecular (FMP), criaram um mapa incomumente detalhado de como o vírus influenza A altera a forma das células humanas infectadas. Seu fluxo de trabalho individual permitiu observar interações proteicas diretamente dentro de células intactas, em vez de depender apenas de amostras que haviam sido decompostas.
A gripe sazonal causa 3 a 5 milhões de casos de doenças graves em todo o mundo todos os anos e mata até 650 mil pessoas. A gripe A também causou muitas pandemias, incluindo a pandemia de gripe espanhola de 1918.
Depois de entrar na célula, o vírus libera RNA que contém instruções para produzir um pequeno conjunto de proteínas virais. Essas proteínas se espalham pela célula hospedeira e redirecionam seus sistemas moleculares, transformando a célula em um local para a produção de novas partículas virais.
Mapeando o vírus influenza dentro de células intactas
Uma melhor compreensão desta absorção poderia ajudar os cientistas a desenvolver vacinas contra a gripe e medicamentos antivirais mais eficazes. Para atingir este objetivo, os investigadores precisam de saber quais as proteínas virais que interagem com as proteínas humanas, onde ocorrem esses contactos e como o vírus as utiliza para apoiar a sua própria replicação.
O novo estudo é o primeiro a revelar contactos directos entre proteínas do vírus influenza e proteínas humanas em grande escala dentro de células infectadas intactas. Os detalhes estruturais também foram precisos o suficiente para que os pesquisadores modelassem como as proteínas em interação poderiam se encaixar.
“Nosso trabalho fornece uma nova maneira de estudar as interações influenza-hospedeiro em seu contexto nativo e com visão estrutural”, disse Jan Kasinski, líder do grupo no EMBL Hamburgo e no Centro de Biologia de Sistemas Estruturais (CSSB). “Os resultados atuais são um instantâneo de um momento durante a infecção e abrem caminho para o estudo das interações influenza-hospedeiro ao longo do ciclo de infecção”.
Superando o principal problema experimental
Rastrear as interações proteína-proteína durante a infecção ativa é extremamente difícil. Muitos estudos anteriores dependiam de métodos bioquímicos que exigiam que os cientistas rompessem as células antes de medir os contactos proteicos.
Este processo pode distorcer o que acontece dentro de uma célula viva. Após a quebra dos compartimentos internos, as proteínas que foram inicialmente separadas podem entrar em contato em laboratório. Ao mesmo tempo, as interações fracas, transitórias ou específicas do local podem desaparecer. Como resultado, pode ser difícil para os pesquisadores determinar quais conexões realmente existiram durante a infecção.
“Então descobrimos que nossos colaboradores Boris Bogdanov e Fang Liu da FMP Berlin desenvolveram uma versão especializada de espectrometria de massa de reticulação (XL-MS), uma técnica estabelecida há muito tempo para mapear contatos de proteínas, adaptada especificamente para células infectadas por vírus”, disse Kasinski.
Um método especializado proporcionou o avanço que a equipe precisava. Isso possibilitou capturar interações que ocorreram apenas por um curto período de tempo ou em regiões específicas da célula infectada.
“O XL-MS nos permite capturar interações proteína-proteína diretamente em células infectadas e intactas, e também fornece informações estruturais sobre como essas interações ocorrem”, explicou Bogdanov, que agora é líder de um grupo de pesquisa júnior no Instituto de Virologia Charité – Universidade de Berlim. “Isto dá-nos uma compreensão da interacção entre o vírus e a célula humana e pode, através da modelação estrutural, ajudar a identificar alvos accionáveis para futuras intervenções farmacêuticas”.
Combinando dados experimentais com AlphaFold
Os pesquisadores combinaram seus resultados do XL-MS com modelagem estrutural computacional. Isto permitiu-lhes identificar as proteínas virais e humanas que interagem e avaliar como estas proteínas se posicionam na junção.
Para criar esses modelos estruturais, a equipe usou uma versão modificada do AlphaFold, um algoritmo de previsão de estrutura de proteínas ganhador do Prêmio Nobel.
“A principal vantagem da abordagem AlphaFold modificada é que ela nos permitiu alimentar nossos dados experimentais de reticulação diretamente em simulações estruturais”, explicou Kosinski. “Ele mostra padrões de quais partes do vírus e das proteínas do hospedeiro estão próximas umas das outras dentro das células infectadas. Isto tem sido particularmente útil para complexos vírus-hospedeiro, que muitas vezes são difíceis de prever com segurança”.
A gripe infecta células humanas de duas maneiras
Resultados publicados em Microbiologia da naturezamostraram duas estratégias proeminentes que a gripe A parece usar quando assume o controle de uma célula.
No centro do primeiro está a hemaglutinina, uma proteína encontrada na superfície do vírus. A gripe usa hemaglutinina para se ligar e invadir as células hospedeiras. Os pesquisadores acompanharam essa proteína enquanto ela se movia pela rede interna de transporte e processamento da célula.
Essa rede é composta por compartimentos que montam, modificam e preparam proteínas antes de enviá-las ao destino final. A análise mostrou que várias proteínas humanas ajudaram a dobrar e modificar adequadamente a hemaglutinina durante a infecção. Algumas destas proteínas hospedeiras tinham anteriormente funções pouco compreendidas.
A gripe dissolve as estruturas do núcleo
A segunda descoberta envolveu paraspeckles, pequenos compartimentos semelhantes a gotículas localizados dentro do núcleo da célula. A equipe descobriu que a infecção por influenza A causou a dissolução dessas estruturas.
À medida que os paraspeckles se desintegravam, eles liberavam as proteínas de ligação ao RNA contidas neles. O vírus pode então usar essas proteínas para apoiar a sua própria replicação.
“O que mais nos surpreendeu foi o parabake”, disse Yulia Kotava, ex-bolsista de pós-doutorado do grupo de Kasinski no EMBL em Hamburgo, agora na ETH Zurique, e primeira autora do artigo. “Observar essas minúsculas organelas no núcleo se dissolverem sequencialmente em cada linhagem celular e em cada cepa de gripe que testamos nos mostrou que isso não é um efeito colateral da infecção – pode ser uma estratégia”.
A interrupção pode trazer diversas vantagens à gripe.
“Também pode haver uma segunda vantagem para o vírus: algumas evidências sugerem que os paraspeckles contribuem para as respostas ao estresse celular e para a regulação dos genes antivirais, portanto, interrompê-los também pode enfraquecer partes da resposta protetora da célula”, acrescentou Kosinski.
Esforços conjuntos de três instituições
O projeto contou com tecnologias comuns e experiência das três instituições. Os pesquisadores realizaram o trabalho de espectrometria de massa de reticulação na Charité, em Berlim. A análise glicoproteômica foi concluída no EMBL Proteomics Core Facility.
A equipe realizou as simulações AlphaFold no EMBL Compute Cluster, enquanto a microscopia foi feita na Instalação Avançada de Microscopia de Luz e Fluorescência (ALFM) do CSSB.
Uma nova maneira de estudar possíveis vírus pandêmicos
As descobertas demonstram como o estudo das interações moleculares em células infectadas intactas pode revelar onde e como o vírus assume o controle da maquinaria celular humana. Os pesquisadores dizem que esse tipo de “mapeamento em contexto” também poderia ajudar a explicar como outros vírus funcionam.
“Embora os fatores e mecanismos exatos do hospedeiro muitas vezes difiram de vírus para vírus, acreditamos que nossa abordagem geral – combinando reticulação intracelular, modelagem estrutural e vigilância biológica celular direcionada para mapear interações nativas vírus-hospedeiro em estágios específicos da infecção – permanece amplamente aplicável”, disse Kasinski.
Embora o estudo tenha estudado uma cepa de gripe adaptada em laboratório, os pesquisadores acreditam que a mesma estratégia poderia eventualmente ser usada para estudar vírus com maior potencial pandêmico.
Bogdanov concorda: “Embora este estudo se concentre numa estirpe adaptada em laboratório, este estudo estabelece as bases para a aplicação da metodologia a potenciais vírus pandémicos como o H5N1 e para a identificação das redes de interacção que suportam a sua replicação em células humanas”.
