O DNA consiste em longas cadeias moleculares que carregam as instruções genéticas necessárias para a vida. Na engenharia genética, os pesquisadores cortam o DNA em locais cuidadosamente selecionados e unem esses pedaços a outras sequências de DNA. Este processo suporta uma ampla gama de aplicações, incluindo melhoramento de culturas, tratamento de doenças genéticas e criação de modelos animais utilizados no desenvolvimento de medicamentos.
Para unir com eficiência pequenos pedaços de DNA, os cientistas contam com sequências pendentes chamadas extremidades adesivas. Essas seções expostas ajudam os fragmentos de DNA a se unirem. No entanto, a produção de pontas adesivas adequadas requer cortes muito precisos em locais específicos, algo que as tecnologias existentes nem sempre conseguem resolver bem.
Agora, pesquisadores japoneses desenvolveram um método que utiliza nanopartículas de prata para cortar e unir DNA em locais específicos. Esta técnica produziu eficiências de montagem de DNA duas a cinco vezes maiores que os métodos convencionais de enzimas de restrição. As descobertas foram publicadas em Pesquisa de ácidos nucléicos.
Limitações da montagem normal do DNA
Os métodos padrão para montar moléculas longas de DNA geralmente usam enzimas de restrição para fazer cortes e DNA ligase T4 para unir os fragmentos resultantes. No entanto, as enzimas de restrição só podem reconhecer e cortar sequências específicas de DNA. Eles também tendem a produzir pontas adesivas relativamente curtas, o que pode reduzir a eficiência do processo de emenda.
Em busca de uma alternativa, uma equipe liderada pelo professor Hiroshi Abe e pelo professor assistente Masahito Inagaki da Universidade de Nagoya, em colaboração com o professor Natsuhisa Oka da Universidade de Gifu, investigou se as reações químicas poderiam ser usadas para cortar o DNA em locais selecionados, em vez de depender de enzimas de restrição.
Os pesquisadores investigaram uma reação relatada pela primeira vez entre 1990 e 1992, na qual os íons de prata clivam o DNA modificado com 3′-tiol em locais específicos. Eles testaram se essa reação poderia ser usada para produzir pontas adesivas úteis. Os íons de prata foram eficazes na clivagem do DNA, mas foram adsorvidos e precipitados de forma não específica. Como resultado, apenas cerca de 14% do ADN pode ser recuperado, o que é demasiado baixo para aplicações práticas.
Nanopartículas de prata melhoram a recuperação do DNA
A próxima equipe substituiu os íons de prata por nanopartículas de prata. Os pesquisadores argumentaram que as nanopartículas poderiam ser separadas da mistura de reação por centrifugação, o que tornaria mais fácil a recuperação posterior do DNA.
Os testes iniciais mostraram que a eficiência da clivagem do DNA atingiu cerca de 50% a 70°C e quase 100% a 95°C em duas horas. No entanto, estas temperaturas podem danificar longas moléculas de ADN, criando outra barreira à utilização prática.
Para resolver este problema, os investigadores revestiram as nanopartículas com polietilenoglicol (PEG), um polímero solúvel em água, para melhorar a sua estabilidade e dispersibilidade. Este revestimento aumentou a eficiência de clivagem do DNA de 36% sem PEG para 92% com PEG a 37°C em 31 h. “Em última análise, otimizamos as condições para um nível prático e, à temperatura ambiente, alcançamos uma eficiência de clivagem modificada com PEG de mais de 91% a 50°C em apenas uma a duas horas”, disse Inagaki, primeiro autor do estudo.
A abordagem das nanopartículas trouxe outra vantagem importante. Fragmentos de DNA indesejados permaneceram ligados às superfícies das nanopartículas, enquanto fragmentos desejados contendo extremidades adesivas permaneceram em solução. Este efeito de purificação interna aumentou a taxa final de recuperação do DNA de 14% para 98%.
Extremidades pegajosas mais longas promovem a ligação ao DNA
As nanopartículas de prata também permitem aos pesquisadores produzir fragmentos de DNA com extremidades adesivas de 8 bases que são difíceis de produzir usando enzimas de restrição convencionais. Quando os cientistas usaram a DNA ligase T4 para unir esses fragmentos, a eficiência do splicing foi quase duas vezes maior do que com os métodos tradicionais.
Esta melhoria foi ainda maior com balanços mais longos. Usando uma saliência de 18 bases, os pesquisadores alcançaram uma eficiência de emenda de 44%. Em comparação, um balanço típico de 4 bases produziu apenas 8% de eficiência, dando ao novo método uma vantagem cinco vezes maior.
Para testar se este método poderia funcionar num ambiente biológico prático, a equipe clonou um pedaço de DNA que codifica a proteína fluorescente verde (GFP). Eles então introduziram o DNA montado em células HeLa humanas. As células expressaram GFP com sucesso, confirmando que o DNA foi montado com precisão.
Aplicações potenciais em terapia genética e DNA sintético
“Acreditamos que esta tecnologia será útil para a síntese de ADN genómico, com muitas aplicações em áreas como a construção de bibliotecas de mRNA para vacinas contra o cancro e terapia genética, bem como no desenvolvimento de medicamentos proteicos sintéticos e produtos genómicos”, disse Inagaki.
Agora os pesquisadores querem determinar se a técnica pode ir além de conectar apenas dois pedaços de DNA por vez. Ele também explicou o próximo passo: “Mostramos que dois pedaços de DNA podem ser unidos. Agora, precisamos confirmar se vários pedaços podem ser unidos ao mesmo tempo – um passo fundamental para fazer DNA em escala genômica.”
Este trabalho foi apoiado pela Agência Japonesa de Ciência e Tecnologia (JST) (JPMJCR18S1, JPMJCR23N1, JP25H00427, JP24H00737, JP22H02219, JP22K21346) e pela Agência Japonesa de Pesquisa e Desenvolvimento Médico (AMED). [JP22gm0010008 (LEAP), JP25ak0101289, JP223fa827 (SCADA), JP243fa827032 (SCADA), JP23bm1223009, JP24ek0109697, JP25ama221315, JP25km0405209, JP25ama221230; JP23fk0210133) and Tanaka Kikinzoku Memorial Foundation [Precious Metals Research Grants 2021 Silver Award to M.I.]. O financiamento para pagar a publicação em acesso aberto deste artigo foi fornecido pela Agência Japonesa de Ciência e Tecnologia.
